高二生物选修1知识点总结(3)
《血红蛋白的提取和分离》
基础知识
1.凝胶色谱法
凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ;而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2.缓冲溶液
缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是 ，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3.电泳
电泳是指 。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。
4.蛋白质的提取和分离
蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。
5.样品处理
血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有
的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ，其作用是
，血红蛋白有 个肽链组成，包括 ，其中每条肽链环绕一个 ，磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。
红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。
6.凝胶色谱操作
第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是 。
[疑难点拨]
1.凝胶色谱法分离蛋白质的原理
凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。
2.与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义
哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
3.电泳的作用及其原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电;在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
4.你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗?
答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
[典例解析]
用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质( D )
A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快
解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
经典例题剖析
例题1、关于果酒制作过程中的叙述正确的是( B )
A先去烂子粒和枝梗，再用清水冲洗污物 B发酵的温度维持在20℃最好
C发酵过程中需要适时打开瓶盖放气，以防发酵瓶破裂 D需要不断的充入氧气
解析：为防杂菌污染，烂子粒应该冲洗之前去除，而去枝梗应在冲洗之后;酵母菌酒精发酵需在无氧条件下进行，通气时只能拧松瓶盖不可打开瓶盖;最适宜温度为20℃。
例题2、关于果醋制作过程中的叙述正确的是( C )
A打开发酵瓶是因为全过程需要通入氧气，排出二氧化碳
B醋酸菌在糖源和氧气充足时，能将葡萄糖分解成醋酸和二氧化碳
C当糖源不足时，醋酸菌可将酒精分解成醋酸
D要使果酒变成果醋只需通入氧气，加入醋酸菌就可以了
解析：醋酸菌和酵母菌发酵的区别在于前者需氧，不产生二氧化碳，而且发酵的最适温度也不同。
例题3、腐乳制作过程中影响其风味和品质的因素有哪些?( A )
①盐的用量 ② 酒的种类和用量 ③发酵温度 ④ 发酵时间 ⑤辛香料的用量
A①②③④⑤ B ①②③ C ①②⑤ D ③④
解析：盐、酒、辛香料不仅用来调味，还可抑菌，防腐乳变质。适宜的盐的用量和酒的浓度还影响发酵中蛋白酶的作用发挥;发酵时间和温度都会影响腐乳的风味。
例题4、将10毫升酵母菌液放在适宜的温度下培养，并且于不同时间内等量均匀取样4次，分别测定样品中酵母菌的数量和PH，结果如下表。请分析回答：
样品 酵母菌的数量(个/mm3) PH 1 1210 4.8 2 820 5.4 3 1210 3.7 4 1000 5.0 ① 表中样品取样先后次序是
②对酵母菌而言，10毫升该培养液的环境负荷量为 个。
③若第五次均匀取样时，样品中的酵母菌数量为760(个/mm3)，产生这一结果的原因是 。
解析:(1)由于酵母菌进行有氧呼吸和无氧呼吸都产生二氧化碳，使发酵液的酸性增强。根据样品PH大小，越早取样PH越大，由此取样顺序为2、4、1、3。
(2)经过培养10mL培养液中有菌数1210个/mm3，环境负荷量应为1.21×107。
(3)培养液中的营养物质不断被消耗，pH值减小，部分酵母菌因营养缺乏不适应而死亡并解体。
答案： 2、4、1、3;1.21×107;培养液中的营养物质不断被消耗，pH值减小，部分酵母菌因营养缺乏不适应而死亡并解体。
例题5、水果罐头盖上印有"如发现盖子鼓起，请勿选购"的字样，引起盖子鼓起的最可能原因是( B )
A、好氧型细菌呼吸，产生CO2和H2O B、酵母菌呼吸，产生CO2和C2H5OH
C、乳酸菌呼吸，产生 CO2和 C3H6O3 D、酵母菌呼吸，产生CO2和 H2O
[解析] 罐头是密封、杀菌的，但不排除有微生物的孢子等存活下来，只有进行无氧呼吸的微生物可以生存;罐头鼓胀是过期后微生物生活产气的结果，乳酸菌无氧呼吸产生乳酸，无气体产生;酵母菌既可以在有氧条件下生活，也可以在无氧条件下发酵产生酒精和二氧化碳。
例题6、有人测定了A、B、C、D四种植物体内多种酶的活性与温度的关系，结果如下图所示。根据图中的信息，你认为在25摄氏度条件下，竞争能力最强的生物和对温度适应范围最广的生物分别是( A )
A B和D B B和C C B和A D A和C
催 C D
化 100 A B
效
率 50
( %)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
[解析] 酶活性具有一定的温度范围和适宜温度，温度过高酶会失活，低温对酶活性抑制;在一定温度下，最适宜该温度的酶活性最强，该生物生活的也最好，竞争力就强;酶有活性的范围最大，生物的生存温度范围就越广。
例题7、(05年杭州高三第一次检测)下图是人体内某个化学反应的示意图，图中代表酶的英文字母是( A )
[解析] 酶是起催化作用的，它在反应前后的性质保持不变，据图可以解释A 所代表的物质是酶。所以在特定条件和一定的时间内，酶的催化作用可以一直保持。
例题8、(04年北京东城区综合检测) 实验研究pH对酶活性的影响，准备5支含有等量胃蛋白酶溶液但pH各不相同的试管，每支试管加1块1 cm3的正方体凝固蛋白块，试管均置于25 ℃室温条件下，将各试管蛋白块消失的时间记录于下表：
酶溶液的pH 蛋白块消失的时间(min) 1
2
3
4
5 13
9
11
45
>60 (1)酶活性最强时的pH是_________。
(2)蛋白块消失的时间与酶活性强弱的关系是_________。
(3)请以2种方法改进实验，使实验在更短的时间内完成。
(4)在人体消化道中，能分泌本实验中酶的部位是_________。
(5)为确认蛋白块的消失是由于酶的作用，还应对实验进行什么设计
[答案] (1)2
(2)酶活性越大，蛋白质分解越快，蛋白块消失的时间越短
(3)方法Ⅰ：将题给温度由25℃提高至大约37℃。方法Ⅱ：将原题中正方体蛋白块处理得更小(如切成0.5×0.5×0.5=0.125 cm3)，这相当于消化道内进行的物理性消化
(4)胃(答小肠不给分，因pH与题意不符)
(5)另增加一个试管，放入等量的蛋白块并将pH调得适当，但不加酶溶液
例题9、现有相同容积的玻璃缸几只，利用自然的清水、同龄且发育状态相同的小蝌蚪60只、饲喂蝌蚪的饲料、未经处理的具有生物活性的甲状腺激素，并把具有生物活性的甲状腺激素放在50℃的温水中处理10 min。根据这些现有的条件，请你设计一个实验，验证甲状腺激素经过处理以后，是否还有生物活性。?
(1) 实验方案的设计
第一步，取玻璃缸3只，分别标记为甲、乙、丙;
第二步， ;
第三步，如果甲缸每天饲喂饲料，丙缸每天饲喂用具有生物活性的甲状腺激素相拌的饲料，则乙缸怎样饲喂? ;
最后经过一定时间的饲喂，观察现象，得出结果和结论。?
(2) 结果分析
①若乙、丙缸的蝌蚪发育同步，迅速变态为小青蛙，而甲缸还是蝌蚪状态，说明
;
②若甲、乙缸的蝌蚪发育同步，而丙缸发育变态迅速，说明了 ?
。
③若乙缸的蝌蚪发育比甲缸快，比丙缸慢，则说明了
。?
(3)该实验设置甲、丙两组实验的目的是 。?
[答案](1)分别加入等量的清水和20只蝌蚪 每天饲喂用经过处理过的甲状腺激素
相拌的饲料
(2)①甲状腺激素经过50℃的温水处理后，对其生物活性没有影响 ②甲状腺激素经过50℃的温水处理后，完全丧失了生物活性 ③甲状腺激素经过50℃的温水处理后，使生物活性有所降低
(3)起对照作用
例10、 在DNA分子的粗提取实验中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是( )
A. 稀释血液、冲洗样品
B. 使血细胞破裂，降低NaCl浓度使DNA析出
C. 使血细胞破裂，增大DNA溶解度
D. 使血细胞破裂，提取含杂质较少的DNA
解析：在该实验过程中，第一次加入蒸馏水的目的是使血细胞过度吸水而破裂，以便核物质溶解。第二次加入蒸馏水是为了降低NaCl浓度至0.14mol/l，因为此时的DNA溶解度最小，可使DNA析出。
例11、 在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是( A )
A. 防止凝血 B. 加快DNA析出 C. 加快DNA溶解 D. 加速凝血
解析：柠檬酸钠的作用是利用柠檬酸根离子与血浆中Ca2+离子结合成柠檬酸钠，降低Ca2+离子浓度，使有关凝血酶活性降低。因此柠檬酸钠是抗凝血物质，防止凝血，有利于鸡血细胞液的制备。
例12、去除DNA杂质时，可直接在滤液中加入( A )，反应10-15min
A. 嫩肉粉 B. 蒸馏水 C. 2mol/lNaCl D. 酒精
解析：嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质
例13、 DNA在NaCl溶液中溶解度有二重性，随着NaCl溶液的变化而变化。
(1)请在下列NaCl溶液中选出溶解度能使DNA析出最彻底的一种( )和溶解度最高的一种( )
A. 0.14mol/l B. 2mol/l C. 0.15mol/l D. 0.3mol/l
(2)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液，利用这一原理可以____________，可以推测溶于酒精中的物质可能有____________。
(3)利用DNA与_____变蓝色的特性，将该物质作为鉴定______的试剂。其实验过程要点是向放有_____的试管中加热4ml的____。混合均匀后，将试管置于___5min，待试管______，观察试管中溶液颜色的变化，这个实验也说明DNA耐___温。
解析：根据实验原理可知DNA在0.14mol/l的NaCl溶液中溶解度最低，在高浓度2mol/l中，溶解度最高。DNA存在于染色体上，为了把DNA和其他物质分开，采取DNA不溶于酒精的方法，目的是除去杂质;利用DNA与二苯胺(沸水浴)成蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA。
答案：(1)A;B
(2)除去杂质;某些脂类、蛋白质、糖类或其他大分子物质
(3)二苯胺;DNA;DNA;二苯胺试剂;沸水中水浴加热;冷却后;高
例14、关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面叙述中正确的时( D )
A. 随着NaCl溶液浓度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大
B. 随着NaCl溶液浓度的减少，DNA在NaCl溶液中的溶解度也减少
C. DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关
D. 当NaCl溶液的浓度为0.14mol/l时，DNA的溶解度最低
例15、在"DNA的粗提取与鉴定"的实验中，将提取获得的含有DNA的粘稠物(还含有较多杂质)分别处理如下：
第一， 放入0.14mol/l的NaCl溶液，搅拌后过滤，得滤液A和粘稠物a
第二， 放入2mol/l的NaCl溶液，搅拌后过滤，得滤液B和粘稠物b
第三， 放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液C和粘稠物c
以上过程获得的滤液和粘稠物中因含DNA少而可以放弃的是 A、b、C 。
解析：在不同浓度的NaCl溶液中DNA的溶解度是不同的。在0.14mol/l的NaCl溶液中DNA的溶解度最小，呈丝状物析出。在2mol/l的NaCl溶液中DNA的溶解度最大，所以DNA呈溶解状态，过滤后存在于滤液中。酒精溶液可使DNA分子凝集，呈丝状物，过滤后存在于粘稠物中。
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