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中国药典黄曲霉毒素检测过程有关问题解析
黄曲霉毒素( aflatoxin，AF) 是由黄曲霉( asperillusflavus) ，寄生曲霉( asperillus parasiticus) 等真菌产生的一类分子结构相似的次级代谢产物，是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类致癌物，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一。中药材在生长和储存过程中，若环境条件适宜便会滋生霉菌从而产生黄曲霉毒素。目前黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱-质谱联用法等，中国药典2010年版第二增补本采用高效液相色谱柱后衍生法测定。本文就中国药典黄曲霉毒素检验过程中常遇到的问题以及无衍生快速检测黄曲霉毒素的方法进行初步探讨。
1 仪器与试药
Agilent1200 型高效液相色谱仪; Pickering Vector-PCX 柱后衍生装置; Waters 含FLR 检测器的ACQUITYUPLC H-Class 系统; SB-5200D 超声清洗器( 宁波新芝生物科技有限公司) ; K2042 高速离心机( 美国Kingdom) ; AE-100 电子天平( 瑞士Mettler) 。免疫亲和层析柱( A、B、C 公司) ; 玻璃纤维滤纸( 北京中检维康科技有限公司) ; 黄曲霉毒素混合对照品溶液( 美国SUPELCO 公司，批号: LB74656，黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1浓度分别为0.302、0.965、0.306、1.021 g /mL) 。甲醇、乙腈均为色谱纯，所用水为纯化水。地龙( 批号11008ZY04) 为汕头美宝制药有限公司提供; 陈皮( 批号110901) 为广州中一药业有限公司提供; 薏苡仁( 批号20130101B) 为广州市香雪制药股份有限公司提供; 柏子仁A、B、C 分别购自广州大参林、广州同健和广州采芝林药店，批号自编。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取本品粉末约5 g( 过二号筛) ，精密称定，加入黄曲霉毒素( aflatoxin，AF) 是由黄曲霉( asperillusflavus) ，寄生曲霉( asperillus parasiticus) 等真菌产生的一类分子结构相似的次级代谢产物，是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类致癌物，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一。中药材在生长和储存过程中，若环境条件适宜便会滋生霉菌从而产生黄曲霉毒素。目前黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱-质谱联用法等，中国药典2010年版第二增补本采用高效液相色谱柱后衍生法测定。本文就中国药典黄曲霉毒素检验过程中常遇到的问题以及无衍生快速检测黄曲霉毒素的方法进行初步探讨。
2.2 超高效液相色谱和荧光检测器无衍生法快速检测黄曲霉毒素
2.2.1 线性关系、检测限和定量限精密吸取黄曲霉毒素混合标准品溶液( 黄曲霉毒素B1浓度为102.1 ng /mL) ，分别加50%甲醇制成浓度为每毫升含AFB10.204 2、0.408 4、2.042 0、6.126 0、20.420 0ng 的标准品溶液，摇匀，即得。分别精密吸取对照品溶液2 L，注入色谱仪中，记录峰面积，以浓度( ng /mL) 为横坐标，积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明4 种黄曲霉毒素线性关系良好。按进样浓度分别为信噪比的3 ∶1 和10 ∶1 计算检测限和定量限。
2.2.2 仪器精密度试验取黄曲霉毒素混合标准品溶液( B1浓度0.408 4 ng /mL) ，连续进样5 次，结果黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD 分别为0.6%、1.2%、1.0%和0.2%，表明仪器精密度良好。
2.2.3 加样回收率试验取已知含量的桃仁( AFB20.26 g /kg，AFB11.69 g /kg) 样品5.0 g，精密称定，按低、中、高浓度分别加入2、5、10 mL 的黄曲霉毒混合对照品溶液( B1浓度2.042 ng /mL) ，按2.1项下方法制备供试品溶液，进样测定。
2.2.4 样品测定取所收集的柏子仁样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，通过标准曲线法计算供试品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，结果与采用柱后碘衍生法测定结果相差不大。
3 讨论
采用0.01%碘溶液、衍生化泵流速0.4 mL /min与现行中国药典0.05%碘溶液、衍生化泵流速0.3mL /min 的衍生效果相差不大，但降低碘衍生溶液浓度，可以在实际检验过程中有效减少管路堵塞同时明显延长荧光检验器使用寿命。免疫亲和柱对黄曲霉毒素能特异性吸附，可以极大的减少其他杂质的污染，但中药材化学成分复杂，不同品牌的免疫亲和柱的回收率会有差异，因此在实际测定过程，需要根据实际情况选择合适的免疫亲和小柱。AFB1和AFB2在紫外光下可产生蓝绿色荧光，AFG1和AFG2在紫外光下可产生黄绿色荧光，反相洗脱液会淬灭黄曲霉毒素B1和G1的荧光效应，因此通常检测AFB1和AFG1的需要进行衍生。通常AFB1和AFG1的衍生方法主要有柱前三氟乙酸衍生法，柱后碘液法、电化学衍生溴法或光化学UV 衍生法，无论柱前衍生还是柱后碘( 溴) 衍生，均需配制衍生化试剂或增加额外的装置，同时还会造成系统的污染，而液相色谱-质谱联用法相对来说检验成本较高，适合用于阳性样品的确证。本文尝试用沃特世ACQUITY UPLC H-Class 系统，使用大体积的FLR 流通池，延长黄曲霉毒素在流通池的停留时间，从而使黄曲霉毒素检测信号增强，达到无衍生即可测定的目的，同时消除柱后衍生系统和降低带来的谱带展宽，形成尖峰，实现高信噪比，保证了定量更加准确; 另外，采用UPLC 代替HPLC，缩短了分析时间，减少了溶剂的消耗，使分析方法更加环保。致谢: 感谢沃特世科技( 上海) 有限公司曾玮在超高效液相色谱-荧光检测器无衍生快速检测黄曲霉毒素方法的建立上提供的帮助。
中药艾的抗炎免疫研究进展及临床实践
艾，又名冰台(《尔雅》)、艾蒿(《尔雅》郭璞注)、医草(《名医别录》)、炙草(《埤雅》)、蕲艾(《蕲艾传》)、黄草(《本草纲目》)、家艾(《医林纂要》)、甜艾(《本草求原》)、艾蓬、香艾、阿及艾(《中药大辞典》)，菊科蒿属植物(Artemisia argyiLevi.et Vant.)及近邻种的复合称谓，我国各地区及亚洲周边国家均有生长。药用其叶，故药材名为艾叶，性温、味苦辛，归肝脾肾经，为我国传统中草药。艾药用历史悠久，是中医临床常用药物之一。传统药性理论认为，艾叶有理气血、逐寒湿、温经血、安胎、杀虫止痒等作用，可用于治疗虚寒出血，尤宜于崩漏。其用法有水煎服(煎剂)、煎水洗(洗剂)、灸剂、烟熏(烟熏剂)和制酒服(酒剂)。艾的药用功能来源于其中所含化学物质，经不同方式处理(水提、醇提、炙烧等)所获得的化学成分有所不同，主要成分有黄酮类、桉叶烷类、三萜类、鞣质、多糖、挥发油和微量元素等。现代研究通过对艾叶挥发油、艾烟、艾的水提物、艾的醇提物等相关成分进行研究，证实艾化学成分复杂，作用广泛，具有抗菌、抗病毒、平喘、镇咳、祛痰、利尿、抗过敏、抗炎、镇痛、抗疟疾、抗肿瘤、止血、抗凝血、激活补体等功效，对呼吸系统、心血管系统、消化系统、免疫系统等均具有较强的生物学作用。近年来，针对艾在抗炎方面的研究主要集中其挥发油、艾灸的抗炎药效机制和临床应用，以艾为主药或辅药治疗炎性疾病的中药复方研究，并取得了一定的成果。本文对国内外关于中药艾抗炎免疫作用的研究进展进行综述，以期为临床用药提供参考。
1 艾叶油的抗炎免疫作用
现代研究发现，艾叶的主要成分是挥发油，所含化学成分主要有：-蒎烯、-蒎烯、-松油烯、-松油烯、桉叶素、异泽兰黄素、蒿酮、蒿醇、斯巴醇、2-环己烯-1-醇、樟脑、龙脑、4-松油醇、反式-石竹烯、丁子香酚、长叶薄荷酮等。其中桉叶素、樟脑、龙脑、长叶薄荷酮、斯巴醇、异泽兰黄素等具有较强的抗炎作用。因此，在药理实验研究或临床上艾叶油可用于治疗多种炎性疾病。
1.1 艾叶油的抗炎作用
在炎症发生与发展过程中，早、中、晚期的特征各有不同，因此在进行药理研究时可应选择相应的早期渗出和肿胀模型、中期白细胞游走模型、晚期肉芽肿增生模型。蒋涵等研究发现蕲艾挥发油治疗二甲苯致小鼠耳廓肿具有明显的抗炎作用。李波等通过早期乙酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增大、二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致小鼠足肿胀炎症模型，中期羧甲基纤维素(CMC)致白细胞游走炎症模型，晚期小鼠棉球肉芽肿炎症模型，研究发现艾叶油对炎症发生早、中、晚期均有抑制作用。其中，对炎症早期的抗炎效果尤为明显，主要表现在增加毛细血管通透性，减少组织液的渗出和降低肿胀程度;艾叶油的炎症早期抗炎机理为通过抑制PGE2的生成和释放、减少MDA的生成和抑制iNOS的活力实现。万毅等通过构建金黄葡萄球菌感染和绿脓杆菌、大肠杆菌感染构建豚鼠阴证疮疡和阳证疮疡模型研究艾叶挥发油的抗阳证疮疡和阴证疮疡作用;结果表明，艾叶挥发油可减少病变部位的组织脱落坏死、促进创面肉芽组织生长、减少炎细胞浸润，对阴证疮疡和阳证疮疡具有良好的治疗作用。
1.2 艾叶油的抗过敏和免疫作用
蒋涵等研究发现，蕲艾挥发油可减轻2，4-二硝基氯苯诱导的迟发性过敏反应，具有良好的抗过敏作用。相关研究表明，艾叶油中成分2-萜品稀醇、葛缕醇可抑制大鼠被动皮肤过敏反应和5-羟色胺引起的皮肤血管渗透性增强。杨红菊研究发现，艾叶挥发油对大鼠被动皮肤过敏反应(IgE介导的速发型变态反应模型)及参与并加重速发型变态反应疾病的Ⅲ型、Ⅳ型变态反应均有明显的抑制作用。体内灌胃给药可抑制小鼠单核吞噬功能、小鼠免疫器官脾脏和胸腺的生长及小鼠体内抗体溶血素的生成。体外实验表明，艾叶油对Com-pound 48/80、钙离子载体金霉素、抗原马血清诱发的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒均有一定程度的抑制作用，还能抑制大鼠腹腔肥大细胞膜上Ca2+ -Mg2+-ATPase和Mg2+-ATPase的活力，抑制Ca2+ 的转运;结果提示，艾叶油不仅是过敏介质的阻释剂，也是过敏介质的拮抗剂，在速发型变态反应的主要环节作用明显。
2 艾灸的抗炎免疫作用
孙思邈《千金方》记载，艾灸治疗疔肿、火疮、发背等感染性疾病。艾灸法种类繁多，常用的灸法主要有艾炷灸、艾条灸、温针灸、温灸器灸。其治疗根本原理为通经脉、调气血、以通为用，即其温热作用及艾的药性作用综合效应。临床实践证明，艾灸在改善情绪、增强免疫、促进代谢、延缓衰老及治疗神经衰弱、焦虑、失眠、抑郁、喘咳、感冒、炎症、疼痛、皮肤病等方面均具有明显的效果。姜劲峰等认为，艾灸抗炎作用是其治疗疾病的主要效应途径，其温通效应对炎性反应的功能障碍、气血阻滞状态具有针对性疗效。艾灸疗法可调节人体免疫功能，对免疫分子、免疫器官、免疫细胞、红细胞免疫等具有调节作用。艾灸疗法的抗炎免疫作用为其防治各类相关疾病提供了理论基础。
2.1 艾灸的抗炎作用
艾灸对大鼠右后足拓与关节肿胀的急性炎症、大鼠棉球性肉芽肿的亚急性炎症和大鼠佐剂性关节炎(AA)慢性炎症均有明显的抗炎、消肿作用，其中对中期、后期炎症的抗炎效果更为明显，可有效预防或减轻AA 大鼠迟发性及全身多发性关节炎，明显抑制炎性递质TNF、IL-1、5-HT、组胺等的释放，改善由炎症反应导致的自由基代谢紊乱情况，进而减轻由脂质过氧化导致的细胞毒性和功能受损状态。艾灸治疗可明显减轻类风湿关节炎(RA)模型大鼠的关节肿胀程度，具有控制炎症的作用。进一步研究结果提示艾灸可能通过抑制中枢海马MELIB受体，下调血清褪黑激素水平，促进抗炎因子IL-4分泌，调节Th1/Th2细胞因子平衡，抑制NF-B信号转导通路，发挥抗炎作用，阻止炎症发展。艾灸还可明显改善实验性RA 家兔全身状况、膝关节肿胀、关节滑膜炎症病理变化，具有明确的抗炎消肿、抑制滑膜炎症作用。
刘密等研究艾灸治疗应激性胃黏膜损伤大鼠效果发现，艾灸足三里、中脘等穴位可使大鼠胃黏膜损伤指数明显下降、血清促炎因子IL-1、TNF-含量降低，抗炎因子IL-10含量升高，减轻炎症反应。吴焕淦等研究发现，艾灸疗法可有效降低溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠IL-1及IGFI的表达，消除UC大鼠肠道炎症，且可起到防治肠纤维化、肠道癌变的作用。赵琛等研究发现，艾灸能改善溃疡性结肠炎大鼠结肠病理情况，通过下调结肠中KGF-l、KGF-2和IL-6蛋白的表达，起到治愈的效果。
王芸等研究发现艾灸可有效改善盆腔炎后遗症大鼠局部SIgA分泌不足、降低TNF-和IL-6的分泌，抑制局部炎症反应，改善盆腔的局部免疫功能。相关研究显示，艾灸可起到延迟动脉粥样硬化(AS)的作用，有效降低AS兔血清中促炎因子SAA、IL-6、TNF-的含量，提高抗炎因子IL-10的含量，促进AS兔主动脉内皮细胞PPAR的表达，抑制AS兔主动脉TLR4的表达。提示艾灸可通过调节炎症因子，激活PPAR的蛋白表达，抑制TLR4活性，起到抗炎、抑制血管平滑肌增殖迁移，最终保护血管内皮细胞，延迟动脉粥样硬化斑块的作用。艾灸可降低腰神经根受压大鼠模型局部炎性因子含量;降低创伤性膝关节炎模型兔血清中的炎性因子含量，减轻关节软骨损伤程度;预先艾灸能够显著降低脑缺血再灌注大鼠血清炎性细胞因子的含量，预防大鼠脑缺血再灌注过程中的炎性反应，保护神经元。
2.2 艾灸的免疫调节作用
周峰等在豚鼠结核杆菌感染后以艾炷灸治疗，发现豚鼠腹腔渗出液中中性粒细胞吞噬细菌能力明显增高，成熟巨噬细胞增多，吞噬作用增强。唐照亮等采用氢化可的松致小鼠免疫功能低下模型研究艾灸的免疫调节作用，发现艾灸可起到保护胸腺、脾脏等免疫器官，增强及改善机体的免疫功能，纠正自由基代谢的紊乱，调整神经递质NE、5-HT、NO的失衡，促进内环境稳定。实验结果提示，外周交感神经参与艾灸对免疫的调节，部分作用通过肾上腺皮质系统而发挥，通过神经-体液调节途径，多环节、多靶点调节脏腑经络，平衡阴阳，稳定机体内环境，从而起到免疫调节作用。罗玲通过D-半乳糖注射形成的亚急性衰老免疫低下模型和佐剂性关节炎免疫紊乱模型研究艾灸免疫调节作用的局部作用机制，研究发现艾灸可纠正衰老低下的免疫状态，可能与艾灸施术部位的MHC-Ⅱ、IL-2、CD80及波形蛋白的皮肤免疫激活有关。艾灸可调整佐剂性关节炎模型紊乱的免疫功能，可能与下丘脑和穴位局部的瘦素、瘦素受体的表达增强有关。艾灸对免疫调节的局部作用可能与神经免疫网络有关，形成皮肤-神经免疫网络调节机制。
2.3 艾灸抗炎免疫临床研究
从适应病谱分析发现，艾灸可有效治疗多种炎性疾病，包括桥本甲状腺炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、慢性非细菌性前列腺炎、慢性盆腔炎等。国家重点基础研究发展计划(973计划)灸法作用的基本原理与应用规律研究项目研究表明，艾灸对炎症性肠病、浅表性胃炎、类风湿性关节炎、腰椎间盘突出症、高脂血症-动脉硬化具有良好的临床疗效。
艾瑞可研究发现，临床上采用艾灸治疗类风湿关节炎可改善类风湿关节炎患者的各项指标，提高患者的自身免疫功，增强体质，患者症状呈渐进性的快速改善。岳宝安等将354例类风湿关节炎患者随机分为治疗组与对照组各177例，治疗组患者采用隔药艾灸法治疗，对照组患者给予中药辨证治疗;2个疗程后，结果显示：治疗组患者痊愈96例，显效58例，好转14例，总有效率97.67%;对照组患者痊愈56例，显效46例，好转38例，总有效率81.40%。提示隔药艾灸治疗类风湿性关节炎疗效确切。
胡国胜等对36例桥本氏甲状腺炎患者采用艾灸治疗，结果显示，艾灸疗法可明显下降桥本氏甲状腺炎患者外周血淋巴细胞OKT4+/OKT8+ 细胞比值和淋巴细胞分泌甲状腺抗体TGA、MCA 的水平;研究认为，艾灸可能是通过调整T淋巴细胞亚群的比例关系来抑制B淋巴细胞产生抗甲状腺抗体的水平，从而达到治疗桥本氏甲状腺炎的效果。施征等[33]采用艾灸治疗109例溃疡性结肠炎(UC)患者，随机分为隔药灸组(n=61)与隔麸灸组(n=48)，6个疗程后，结果显示隔药灸组患者痊愈32例，好转24例，总有效率91.8%;隔麸灸组患者痊愈15例，好转23例，总有效率79.17%，隔药灸治疗效果明显优于隔麸灸治疗。治疗后，隔药灸组患者结肠黏膜组织的IL-8、ICAM-1表达明显降低，艾灸对UC的作用机理可能是通过抑制IL-8、ICAM-1的表达，从而达到消除炎症的目的。艾灸还可抑制炎性细胞因子的释放，降低细胞的炎性应激，有效治疗慢性疲劳综合征;显著降低缺血性脑血管病患者的血清炎性细胞因子，有效降低复发率。
3 艾叶复方的临床应用
曾金香等将112例急性乳腺炎患者随机分为治疗组与观察组各56例，治疗组患者采用艾叶、生姜制剂热敷双乳，对照组患者给予温开水热敷，均辅以按摩。1个疗程后，治疗组患者痊愈56例，总有效率为100.0%;对照组患者痊愈13例，好转13例，无效4例，总有效率达43.6%。蔡志钢等采用前炎灵栓剂(野菊花、野艾叶、莲须等)直肠给药治疗慢性前列腺炎患者100例，治疗1～2个疗程后，患者痊愈61例，有效36例，无效3例，总有效率为97.0%。采用艾叶制成注射液同时给予保肝药物治疗慢性肝炎患者123例，其中迁延性肝炎患者39例，治愈28例，显效6例，好转5例;慢性肝炎患者46例，治愈21例，显效19例，好转6例;肝硬化患者15例，显效3例，好转4例，无效8例;总有效率为92.4%。采用艾绒卷熏烫感染部位治疗钩蚴皮炎患者106例，24h内痒感消失者77例，仍有痒感者28例，奇痒者1例;对照组患者50例未加治疗，痒感持续时间短则3～4天，长则5～6天，少数皮炎进展为红肿，水泡或因抓破而溃烂;治疗组患者呼吸道症状(气急、咳嗽)发病率为1.88%，低于对照组的14.00%(P0.05)。采用艾叶复方(白及、桂枝、艾叶等)治疗慢性非特异性溃疡、结肠炎患者36例，3周全部治愈。
4 其他应用
迄今，陆续有艾叶其他活性成分被发现有显著的抗炎免疫作用。如艾烟冷凝物可提高大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的吞噬功能;艾叶多糖可促进小鼠T、B细胞的增殖，对小鼠细胞免疫和体液免疫均有调节作用;艾蒿的水溶性多糖N-乙酰基-D-葡糖胺(FAAP-02)可显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，延长其存活时间，提高其胸腺和脾脏指数，血清IL-2、IL-6、IL-12、TNF-水平和CD4+、CD8+ 脾T淋巴细胞数量，并能通过改善5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的免疫机能障碍达到协同抗肿瘤效果，说明其抗肿瘤活性可能是通过改善宿主的免疫应答实现。艾蒿的倍半萜二聚体化合物DSF-5能抑制小胶质细胞过度激活后分泌的多种炎症介质PGE2、TNF-、iNOS、COX-2、IL-1、GM-CSF、MIP-1，并能显著上调抗炎因子IL-10的表达。通过抑制AKT/IB/NF-B、JNK/P38MAPKs和JAK2/STAT 3信号通路而起到抗炎作用。艾叶发酵物和水提物具有抗白色念珠菌的作用，可降低小鼠阴道白色念珠数，减轻阴道组织病理损伤，减轻炎症，对小鼠白色念珠菌性阴道炎可起到治愈的作用。
5 结语
艾叶应用历史悠久，富含多种活性物质，药源丰富，毒性低，价廉，药效广。但其相关的单体成分的生物活性、药理毒理、药效机制等方面的研究并不系统全面。关于艾叶的抗炎免疫作用方面的基本理论、临床疗效、作用机制及临床安全性评价亦有待进一步深入研究，以促进艾叶在治疗临床各种炎性疾病、增强机体免疫功能的推广和应用。
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