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谈不同构建方法对肾阳虚大鼠模型的影响
肾阳虚大鼠模型是研究中医阴阳学说和补阳药物作用机制的重要手段，它需要符合中医肾阳虚典型症状，如精神萎顿、体毛干枯不齐、反映迟钝等。历来建模方法各式各样，然缺乏比较分析，不同建模方法对大鼠的病理生化产生不同的影响，如腺嘌呤构建的肾阳虚模型同时也会影响生育，适合研究不育症。因此，不同建模方法对于中药药效评价和机制研究也不同。探索简便有效的肾阳虚大鼠建模方法，明确其病理生化变化，对药效学研究及机制探讨具有重要作用。本文报道腺嘌呤和氢化可的松构建的肾阳虚大鼠模型肾脏睾丸及SU、Cr、SOD、MDA 的变化，供研究参考。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物SPF 级雄性SD 大鼠21 只，体重180 ～ 200 g，来源: 广州中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK( 粤) 2013 - 0020。
1. 1. 2 主要试剂及仪器未提纯的腺嘌呤Ameresco( 生产批号: 20130325) ，广州华奇盛生物科技有限公司，氢化可的松( 100mg /20mL，生产批号: 1106021) ，天津金耀氨基酸有限公司。总超氧化物歧化酶( SOD) 测定试剂盒( WST - 1 法，货号: A001 - 1，生产批号:201412) 、丙二醛( MDA) 测定试剂盒( TBA 法，货号:A003 - 1，生产批号: 201412) 、Rat AdrenocorticotropicHormone ( ACTH) Elisa 测定试剂盒( 生产批号:201412) ，南京建成生物工程研究所。BX - 51 型病理图像采集系统( 日本奥林巴斯公司) 。Labsystems Finnpipette100L 单道移液器; Thermo 50 L 8 道移液器; HH - 4 数显恒温水浴锅( 国华电器有限公司) ; 华东电子DG5033A 酶标仪( 南京华东电子集团医疗装备有限责任公司) 。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 分组与造模按随机数字表法把动物分为3组: 空白组( 7 只) 大鼠按2 mL /只皮下注射生理盐水，连续10 d。腺嘌呤组大鼠( 7 只) 皮下注射未提纯腺嘌呤，剂量0. 2 g / ( kgd) ，连续10 d。氢化可的松组大鼠( 7 只) 大腿内侧肌肉丰厚处注射氢化可的松25mg / ( kgd) ，连续13 d。
1. 2. 2 一般情况观测大鼠的活动度、对外界反应的灵敏度、皮毛光泽、饮食、饮水、死亡情况。
1. 2. 3 大鼠自主活动度实验结束后，将大鼠投入干净饲养盒中，适应3 min 后，计算各鼠2 min 内的自由活动时间。
1. 2. 4 大鼠游泳时间自主活动度测量结束后，将大鼠放入盛满常温水的水箱中，测量大鼠放入到开始下沉的时间为游泳时间。
1. 2. 5 标本的采集与制备经过12 h 后，摘眼球取血，血液常温放置1 h 后4 ℃离心机3000 r /min 10 min离心，取血清。大鼠颈椎脱臼处死，取肾脏睾丸观察并称重，把肾脏睾丸用10%甲醛溶液固定并放至- 20 ℃冰箱保存，常规石蜡包埋，切片，HE 染色，光学显微镜下进行组织病理学检查。
1. 2. 6 指标测定血清尿素采用脲酶- 波氏比色法，血清肌酐采用苦味酸速率法，均通过测定吸光光度值计算。血清SOD 水平采用TBA 法，通过测定OD 值计算; 血清MDA 水平采用WST - 1 法，通过测定吸光光度值计算。
1. 3 统计学方法
数据用均数 标准差( 珋x s) 表示，符合正态分布及方差齐性用方差分析，组间比较采用SNK - q 检验，方差不齐采用Dunnett T3 检验，P 0. 05 为有显著性差异。
2 结果
2. 1 各组大鼠表现空白组大鼠无疲倦，活动正常，饮食量逐渐增加，体重增加。腺嘌呤组大鼠疲倦，饮食量减少，体重减轻，体毛稀疏无光泽，有集群现象。氢化可的松组大鼠饮食量减少，体重减轻，注射部位出现大片脱毛，无光泽，甚至脱皮后结痂，有集群现象。
2. 2 各组大鼠肾脏睾丸HE 染色结果空白组大鼠肾脏睾丸表面色泽鲜红，肾皮质与肾髓质结构清晰、分界清晰，生精小管排列紧密，间质细胞丰富，生精小管内的生精细胞排列规则，层次清晰，精子数目多。腺嘌呤组肾脏表面色泽鲜红，体积略增大，肾皮质略微固缩，肾小管管腔变窄，肾间质水肿、充血伴明显的炎性细胞浸润; 睾丸生精小管萎缩变性，排列疏松，间质退化、细胞减少，各级生精细胞排列松散，不规则，精子数量较少。氢化可的松组肾脏表面色泽鲜红，肾皮质固缩不明显，与肾髓质分界清晰，肾间质有炎性细胞浸润; 睾丸生精小管略萎缩，排列疏松，各级生精细胞排列松散，不规则。
2. 3 大鼠脏器指数、自主活动度和游泳时间与空白组比较，腺嘌呤、氢化可的松组大鼠肾脏和睾丸指数均增大( P 0. 05) ，自主活动度游泳时间均较低( P 0. 05) ; 且与比腺嘌呤组比较，氢化可的松组睾丸指数高( P 0. 05) ，自主活动度低( P 0. 05) 。
2. 4 大鼠血清尿素、肌酐水平和SOD、MDA 活力与空白组比较，腺嘌呤组大鼠血清肌酐、SOD 和MDA 活力均增高( P 0. 05) ，氢化可的松组大鼠血清肌酐、SOD 活力均降低( P 0. 05) ，MDA 活力增高( P 0. 05) ; 且氢化可的松组血清肌酐和SOD 活力均比腺嘌呤组低( P 0. 05) 。
3 讨论
阳虚动物建模需要与临床复杂的证候相一致，构建符合临床实际的动物模型对于方药研究有着重要作用。肾阳虚动物模型作为研究补阳药物或方剂的重要手段，目前诊断标准主要采用《中医虚证辨证参考标准》，依据动物的外观、行为等来评判其吻合程度，以确定模型成功与否。本研究发现腺嘌呤或氢化可的松建模，动物均表现出疲倦，饮食量少，体重减轻，体毛稀疏无光泽，反应迟钝，自主活动度降低，游泳时间短等症状，中医认为此乃阳气不振，阴寒内盛，神失所养。阳气不振，温煦推动功能减弱，血脉运行不畅，经络失养，发于皮毛则体毛稀疏无光泽; 影响运化之力，则饮食量少，体重减轻; 无力升腾，则神失所养，疲倦萎靡。《黄帝内经》提到阳主动，阴主静，因此，自主活动度减少，游泳时间减少乃机体阳虚状态。故两种建模方法从临床表现和行为上，均符合肾阳虚证。血清肌酐( Cr) 由外源性和内源性组成，当肾实质损害，肾小球滤过率( GFR) 降低到正常的1 /3 时，Cr就会明显上升; 尿素是蛋白质代谢的终末产物之一，在肝中经鸟氨酸循环生成，进入血液循环由肾脏排泄，当肾实质受到损害时，GFR 降低，血清尿素( SU) 浓度升高。本研究发现，腺嘌呤组大鼠肾脏出现肾皮质略微固缩，肾小管管腔变窄，肾间质水肿、充血伴明显的炎性细胞浸润等病理变化，同时与空白组比较，Cr 水平明显升高，SU 有升高趋势，说明腺嘌呤建模会影响肾小球滤过功能。另外，有研究认为，氢化可的松可促进机体能量的过度消耗，从而出现一系列耗竭现象，即拱背蜷曲，集群，游泳时间缩短等。由于本研究中氢化可的松组大鼠饮食量减少，机体能量又过度消耗，导致肌酐生成的外源和内源途径均减少，可能是其Cr 降低的原因。具体原因有待进一步研究。SOD 是细胞抗氧化酶促防御系统，当体内自由基生成增多时，SOD 可清除超氧阴离子，从而保护细胞免受伤害，故SOD 反映了细胞的自我保护能力。MDA 是自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，当细胞受到氧自由基攻击从而引发链式脂质过氧化反应，就会产生大量MDA 损伤细胞膜，进而使细胞死亡。有研究表明，SOD、MDA 参与肾损伤的调节。本研究发现，与空白组比较，腺嘌呤组SOD 和MDA 活力均增高，考虑大鼠自身能量未被消耗，抵抗能力较强，但其引起肾小球滤过率降低等病理改变，使自由基产生增多，细胞受到氧自由基攻击，故两者均增高。而氢化可的松组SOD 活力降低和MDA 活力增高，与以往研究相同，可能是由于氢化可的松一方面过度消耗机体能量，抵抗外来损害能力减弱，另一方面它又对肾脏睾丸有一定损害作用，自由基产生增多，细胞受到氧自由基攻击反应，从而使SOD 降低、MDA 升高。具体原因有待进一步研究。综上，腺嘌呤与氢化可的松构建肾阳虚模型在虚证表现和肾脏睾丸病变上相似，但作用方式不同，腺嘌呤可能是通过损害肾滤过水平、睾丸生理功能等引起血清肌酐、SOD 和MDA 活力升高，氢化可的松则可能是通过耗散机体能量，减弱机体抵抗能力，影响血清肌酐生成、降低SOD 活力和增高MDA 活力，具体原因有待进一步探究。
谈参七抗癌散抗肿瘤及其镇痛作用
参七抗癌散[医院制剂批号：(98)A11-021]源于武汉科德中医医院张德忠老中医祖传秘方，2002年获武汉市科技进步三等奖，并获发明专利1项(专利号：ZL 02117062.2)。本方由西洋参、三七、半枝莲、南柴胡、白花蛇舌草、夏枯草、甘草、当归、白芍、枳壳组成，具有益气活血、软坚散结、解毒止痛之功效。张德忠院长使用其祖传秘方临床用于治疗肿瘤疾患40余年，治疗肿瘤患者数千例，大多为肺癌患者，能改善患者症状，控制肿瘤发展，减轻病人痛苦，提高生存质量，具有较好的疗效，受到广大患者欢迎。在临床疗效的基础上，武汉市科德中医医院与湖北中医药大学中药资源与中药化学省级重点实验室产学研结合，拟将该医院制剂研制成中药新品种。针对参七抗癌散的主治功效和临床疗效，本文对该制剂抗肿瘤活性和镇痛作用进行了药效学试验研究，取得了良好的试验效果，从而为其临床疗效提供了一定科学依据，也为将其开发中药新品种提供了参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试药物
参七抗癌散由武汉市科德中医医院提供。1.1.2 仪器 二氧化碳培养箱(Thermo Labsystems);酶标仪(Forma Series Ⅱ Water Jacketed);DLSB-5/20低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司);SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);数显恒温水浴锅(常州奥华仪器有限公司)。
1.1.3 试剂
胎牛血清FBS(Gibco);RPMI 1640培养基(Hyclone)，MTT (Sigma);5-氟尿嘧啶(5-Fu，Santa);胰蛋白酶;DMSO;盐酸吗啡注射液(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：120418-1);乙酰水杨酸(中国上海森灏精细化有限公司，99.5%-101.0%);冰乙酸(天津永大化学试剂有限公司);氯化钠注射液(开开援生制药股份有限公司，批号13100123);均为分析纯。
1.1.4 细胞
人非小细胞肺腺癌细胞株A549，由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。
1.1.5 动物
SPF级昆明小鼠，18-22g，由湖北省实验动物研究中心提供。实验动物使用许可证号：SCXK(鄂)2008-0005，置于湖北中医药大学标准动物中心饲养。
1.2 方法
1.2.1 供试药物制备
取一定量的参七抗癌散，倾出内容物，精密称取30g，加8倍量70%乙醇回流提取两次，每次1h，合并滤过溶液，回收乙醇至无醇味，加适量水稀释;首先用石油醚多次萃取，残留水液碱化后用氯仿多次萃取，残留水液酸化后再用乙酸乙酯多次萃取，残留水液继续用正丁醇多次萃取，剩下为残余水液;各萃取液分别减压回收溶剂，得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶性物质;各提取物分别用DMSO溶解备用。
1.2.2 MTT法筛选
参七抗癌散有效部位取处于对数生长期，状态良好A549细胞制成单细胞悬液，接种至96孔培养板，以10%的FBS和1640培养液置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养12h，至细胞长至80%，分别加入参七抗癌散的供试品药液(浓度均为100g/ml)，每个样品设6个复孔，然后再置37℃、5%二氧化碳培养箱继续培养24h，设空白对照组和阳性药物对照组(5-Fu，80g/ml)。药物作用时间完成后，弃去96孔板中细胞培养液，分别向96孔板中加入5mg/ml MTT溶液，每孔10l，置入培养箱中孵育4h。最后加入100l/孔的DMSO溶液终止反应，用酶标仪在570nm测OD值，实验重复3次，用SPSS 19.0软件处理实验数据，ANOVA法进行统计学分析，结果以珔xs表示。按以下公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=[1-(实验组OD值-空白对照OD值)/(细胞对照OD值-空白对照OD值)]100%。
1.2.3 MTT法测定
参七抗癌散提取物氯仿部位不同浓度抗肿瘤作用 按上述同样方法将A549细胞接种至96孔培养板培养，分别加入参七抗癌散氯仿萃取物不同浓度的供试药物，每个浓度设6个复孔，设4个浓度梯度，加入细胞培养板后的终质量浓度分别为70，90，100，110g/ml，每孔100l。然后再置37℃、5%二氧化碳培养箱继续培养24h，空白对照组和阳性对照组设置同1.2.2。数据统计分析方法同1.2.2，结果以珔xs表示。
1.2.4 参七抗癌散对小鼠醋酸刺激致痛的影响
取体重18-22g SPF级小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组：①生理盐水组：生理盐水0.1ml/10g;②阿司匹林组：100mg/kg;③参七抗癌散低剂量组：2.4g/kg;④参七抗癌散中剂量组：4.8g/kg;⑤参七抗癌散高剂量组：9.6g/kg。各组按10ml/kg灌胃给药1次/d，连续7d。末次给药30min后，各组小鼠按10ml/kg腹腔注射0.8%乙酸，记录注射乙酸后15min内各组小鼠出现的扭体反应动物数，并计算镇痛百分率。实验数据采用SPSS 19.0进行统计学分析，采用ANOVA分析法，结果用珔xs表示。
1.2.5 参七抗癌散对小鼠热刺激的影响选用18-22g雌性小鼠，放入(550.5)℃恒温水浴板上，测定其痛阈值(小鼠足部接触热板到开始舔后足的时间为痛阈值，以不超过30s为合格)。选择合格的小鼠50只，随机分5组：①生理盐水组：生理盐水0.1ml/10g;②盐酸吗啡组;100mg/kg;③参七抗癌散低剂量组：2.4g/kg;④参七抗癌散中剂量组：4.8g/kg;⑤参七抗癌散高剂量组：9.6g/kg。各组按0.2ml/10g灌胃给药，1次/d，连续7d。末次给药30min后，测定给药后15min、30min、60min、90min各鼠的痛阈值(如超过60s，则按60s计算)。
1.2.6 统计学分析
实验数据采用SPSS 19.0进行统计学分析，各组与其给药前采用t检验，给药后各组间重复测量采用ANOVA分析法，结果用珔xs表示，以P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 有效物质部位的筛选
与空白对照组比较，参七抗癌散中颗粒醇提物和氯仿萃取物对A549细胞具有明显的抑制作用，且氯仿萃取物抑制作用极为显著(P0.01)，其他萃取物质部位对肿瘤细胞抑制不明显，故可以推断该胶囊抗肿瘤有效物质主要集中于氯仿萃取物质部位。
2.2 不同浓度氯仿萃取物质部位抗肿瘤作用
可知与空白对照组比较，参七抗癌散氯仿萃取物对A549细胞抑制率较好且抑制率显著(P0.01)，且随着浓度的升高而升高，呈剂量依赖性。
2.3 醋酸刺激扭体反应
实验结果表明，参七抗癌散能减少醋酸所致小鼠的扭体反应次数，与对照组(NS)比较，其高剂量组呈显著性差异(P0.05)，提示参七抗癌散对乙酸所致小鼠的疼痛性反应有较好的对抗作用。
2.4 热板刺激反应
实验结果表明，与对照组(NS)比较，参七抗癌散能提高小鼠的痛阈值，其高剂量组具有显著性差异(P0.05)，提示参七抗癌散对热刺激所致小鼠的疼痛性反应具有较好的对抗作用。
3 讨论
3.1 本论文对参七抗癌散抗肿瘤的有效物质部位进行了筛选研究。采用溶剂法与调节pH 值相结合的萃取方法，将该制剂提取分离为乙醇粗提物，石油醚萃取物质部位(脂溶性物质)、氯仿萃取物质部位(碱性物质)、乙酸乙酯萃取物质部位(酚酸性物质)、正丁醇萃取物质部位(苷类物质)和水溶性物质部位。抗肿瘤活性筛选结果表明氯仿萃取物质部位和乙醇粗提物对肺腺癌A549具有明显抑制作用，其他物质部位未呈现明显活性，从而确定为参七抗癌散抗肿瘤活性物质部位。进一步研究表明该有效物质部位对A549细胞的抑制率呈现剂量依赖性。因此，本项研究结果为参七抗癌散抗肿瘤作用的临床疗效提供了现代药理学实验依据。该制剂抗肿瘤有效物质部位化学成分的分离鉴定、活性筛选及作用机理正在研究中，以期诠释其抗肿瘤的药效物质基础。
3.2 据文献报道，肿瘤患者的剧烈疼痛与前列腺素E2和一氧化氮(NO)的高表达及其含量有关，前列腺素E2的含量与肿瘤大小、分期和有无转移相关。NO作为一种调节细胞多功能的信息分子，对外周及中枢神经痛觉机制中发挥重要作用。凤良元等报道了中药复方芍药甘草汤具有良好的镇痛作用，其镇痛作用机制与前列腺素E2和NO等化学物质有关。本论文研究表明，参七抗癌散具有明显的镇痛作用，该制剂处方中含有芍药和甘草(2∶1)药对，其镇痛机制推测由该药对能抑制前列腺素E2的合成和降低血细胞中NO的含量。
3.3 参七抗癌散制剂临床治疗肿瘤患者数千例，效果良好。本论文采用现代药理学方法对其抗肿瘤生物活性和镇痛作用进行了研究，取得了良好的预期效果，从而为该医院制剂的临床疗效提供了药效学实验依据，并为其开发中药新药品种奠定了一定基础。
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