关于基因的科技论文范文3000字(2)
关于基因的科技论文范文3000字篇二
NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立
作者：刘珍 刘伟 刘行海 王伯瑶 黄宁 吴琦
【摘要】 目的：对炎症细胞因子TNF?α及IFN?γ刺激下，人NOX1基因的表达调控进行初步分析。方法：将NOX1基因5′?端上游序列连接到无启动子的PGL3?BASIC质粒，构建了PGL3?BASIC/NOX1报告质粒。PGL3?BASIC/NOX1质粒转染A549细胞，用TNF?α、IFN?γ刺激12h，双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况。结果：克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性，在TNF?α和IFN?γ共同刺激下，转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高(约4.3倍)。分析显示NOX1基因5′?端上游序列片段含有NF?κB结合位点，提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NF?κB位点激活相关。结论：NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控，提示该基因可能参与机体免疫防御(特别是上皮细胞免疫防御)，值得进行深入研究。
【关键词】 NOX1;报告基因;TNF?α;IFN?γ
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是一种多蛋白质亚基组成的复合物，表达于吞噬细胞和非吞噬细胞中，能产生对抗病原微生物的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，并参与细胞内信号传导、炎症反应及细胞增殖等过程[1]。在吞噬细胞(中性粒细胞、单核细胞)表达的NADPH氧化酶主要是gp91?phox(NOX2)。
NOX1是近年发现的gp91?phox同源分子，可在非吞噬细胞(上皮细胞、内皮细胞等)表达，当该基因表达增加时，细胞ROS产生增多，与细胞增殖和其他细胞行为相关[2-3]。目前报道最多的是关于NOX与机体丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和酪氨酸蛋白激酶信号转导的关系，ROS引起的细胞氧化还原状态的改变，可激活由MAPK家族不同成员参与的信号转导通路。一般认为NOX家族与机体免疫防御密切相关，但这些分子扮演的具体角色仍待确定，本实验通过构建NOX1基因5′?端上游启动子序列报告基因，初步分析NOX1基因的表达调控机制。
1 材料与方法
1.1 材料
人肺Ⅱ型上皮细胞株A549为本实验室保存。荧光素酶报告基因载体pGL3?basic，海肾荧光素酶内对照报告载体pRL?TK及Dual?Luciferase Report Assay SystemPromega产品。PCR引物由宝生物工程公司合成，限制性内切酶购自MBI公司。DNA Ligation Kit 、PFU酶为TaKaRa 公司产品。质粒DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒及PCR产物纯化试剂盒购自Omega 公司。转染试剂lipofectamine2000购自invitrogen公司。TNF?α、IFN?γ购自PeproTech公司，其余为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与PCR的扩增 根据GenBank中Nox1基因DNA序列(登录号：DQ314883)，设计扩增Nox1启动子序列，扩增片段长度为2096bp，在两条引物分别加上KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。
上游引物P1：CGGGTACCTGAAGGTTGCAGTGAAGGGAGATC。
下游引物P2：GCCTCGAGGGTTTGGAGCCCTTCTAGGC。
PCR反应程序如下：94℃预变性3min;94℃变性40sec，58℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环;最后72℃延伸10min。反应结束后取5μl PCR产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.2.2 报告基因重组质粒的构建 用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ分别酶切PCR产物和质粒pGL3?basic，用DNA连接酶连接两者，将构建好的重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，涂板培养，提取质粒，DNA测序(大连宝生物公司)。
1.2.3 转染 A549细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。转染前一天按照每孔8×104个细胞接种到48孔板，待细胞生长至融合度大于90%，换无血清培养基，用转染试剂进行转染，每孔分别转染2.5μɡ的重组质粒，6小时后换为含小牛血清的DMEM培养基500μL，继续于37℃，5%CO2孵箱培养，用于下一步细胞因子刺激实验。转染质粒为重组的荧光素酶报告基因载体pGL3?NOX1及海肾荧光素酶内对照报告载体pRL?TK，两者的比例为200：1。
1.2.4 细胞因子刺激A549细胞 细胞转染后的24-48小时内进行刺激实验。用TNF?α，IFN?γ刺激A549细胞。实验分组为TNF?α组，IFN?γ组，TNF?α+IFN?γ组。 TNF?α实验用量为25ng·mL-1，IFN?γ实验用量为10ng·mL-1。细胞因子用DMEM培养基稀释，加入转染后的A549细胞，刺激12小时，用Dual?Luciferase Report Assay System试剂盒中的裂解液PLB裂解细胞，收集裂解产物，10000转/分离心10分钟，上请储存于-20℃。荧光素酶报告基因活性测定采用Beckman Coulter DTX880。实验重复3次。用未刺激的转染后的A549细胞做阴性对照。实验数据采用SPSS软件进行分析。
2 结果
2.1 报告基因重组质粒(pGL3?NOX1)的构建和鉴定
PCR产物电泳显示扩增出的片段与实验目的片段大小一致，将PCR片段插入质粒pGL3?basic，用限制性内切酶KpnⅠ及XhoⅠ双酶切重组质粒，也切下相应大小的片段，最后采用DNA测序证实pGL3?NOX1质粒构建成功(图1)。
2.2 细胞因子对pGL3?NOX1报告基因表达活性的影响
细胞因子TNF?α，IFN?γ刺激转染了报告基因的A549细胞，于刺激后12小时裂解细胞，检测荧光素酶活性。结果显示单独采用IFN?γ、TNF?α，或者联合采用两种细胞因子刺激，与转染pGL3?NOX1报告基因而未加细胞因子的对照组(DMEM对照)比较，荧光素酶活性分别增加3.2、2.7及4.3倍。经SPSS软件分析，各实验组与对照组相比，均为P<0.05。结果见表1和图2。表1 TNF?α，IFN?γ对NOX1基因报告质粒在A549细胞在中表达的影响
3 讨论
在中性粒细胞、单核细胞等吞噬细胞质膜上, 存在NADPH氧化酶,其主要亚基是gp91?phox,该酶被激活时能招募其他位于细胞质中的亚基,在膜上装配成活化的全酶,是吞噬细胞呼吸爆发及依赖氧杀菌作用的关键分子。近年来在人类基因组中发现了一组gp91?phox结构与活性同源的分子，于是NADPH氧化酶成为一个分子家族，共有7个成员，分别称为NOX1?5，Duox1?2。最先在吞噬细胞发现的gp91?phox现在称为NOX2。
目前对NOX2在机体抗感染免疫防御中的地位有相当深入的了解，但NOX家族其他成员的生理功能还有待研究。由于NOX2只是特异表达于吞噬细胞，NOX家族其他分子则广泛表达于机体各组织器官，它们的生物学功能立即成为令人感兴趣的问题。过去10年对活性氧的生物学活性有了更多认识,它们参与细胞生存、增殖、分化、衰老和死亡等重要生命过程,是一类信号分子[ 3-5]。NOX家族的发现，势必促进组织细胞活性氧的生成代谢及调控机理研究。
鉴于NOX2在免疫防御中的重要功能，必然将NOX家族其他分子与机体抗感染防御相联系，这方面的工作也成为眼下的重点之一。比如有实验揭示活性氧与天然免疫Toll受体信号途径的联系。我们实验室曾发现在泌尿道上皮细胞清除胞内细菌可能有活性氧中的参与。为了深入了解NOX家族与粘膜上皮防御屏障的关系，本文研究建立了NOX1基因荧光素酶报告基因，旨在深入探讨NOX1基因表达调控机制，以及该基因与炎症和免疫反应的关系。通过双荧光报告系统的检测，我们观察到炎症细胞因子(TNF?α，IFN?γ)刺激可以使实验组荧光素酶报告基因活性明显高于对照组，观察细胞因子作用后不同时间报告基因表达水平，以刺激12小时达到顶峰，然后逐渐下降。本实验通过报告基因检测方式，显示 NOX1基因参与细胞炎症反应过程，提示有必要进一步研究该基因在免疫防御中的意义。
而NOX1基因表达调控区段中，细胞因子作用的主要位点，也成为今后研究的重要内容。通过计算机程序(gene?regulation.com)分析，显示本实验克隆的NOX1基因上游区段包含有NF?κB结合位点。NF?κB 转录因子家族，在细胞分化、细胞粘附、细胞凋亡、炎症反应以及天然免疫等过程中发挥着重要作用[ 6-8] 。细胞因子(特别是TNF?α)刺激NOX1基因表达，NF?κB结合位点是否于此相关，值得进一步的实验确定。
【参考文献】
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3 Arnold BS, Shi J, Murad E, et al. Hydrogen peroxide mediates the cell growth and transformation caused by the mitogenic oxidase Nox1 [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(24): 5550-5555.
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